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天然药物萃取研究 2009 桂林
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蜗牛酶 -- 药用植物提取工艺上的重要用酶
作者 林文安 等
福建漳州金田生物科技有限公司 www.snailase.com 福建漳州363000
（中草药及天然药物研究暨萃取分离新技术、新产品交流研讨会==论文选）
中医药研究促进会 2009-10-26 桂林
【摘要】 我们不断地掌握和应用新的科学技术，中草药和药用植物的提取方法也不断在更新。从沿用了数千年的煎煮法发展到现在的超声波、超滤膜、超临界、超低温、超微粉、荷电激活、半仿生和复合酶法。
—— 还会有更先进的方法不断地展现给我们。
本文将向各位介绍复合酶法（蜗牛酶）在药用植物提取上的应用体会和优点。
蜗牛酶本是复合酶，在药用植物提取工艺上可单独应用也可与诸多“超”法联用……。
【关键词】药用植物提取 复合酶法 蜗牛酶
药用植物的主要有效成分被包裹在植物的细胞壁内，植物细胞壁主要是由纤维素，半纤维素，果胶质，木质素等物质构成的紧密结构。有效成分要获得“释放”，就得冲破细胞壁这道“屏障”，复合酶（蜗牛酶）中的纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等能有效溶解、破坏细胞壁的物质结构，使有效成分更容易地破“壳”而出…。
因此，药用植物在进行提取前，先进行酶解预处理，除能够提高有效成分的提取率、促进细胞原生质体的释放外，甚至还会导致细胞间发生新的组合，产生新的有生质，提高药用价值。
一、 蜗牛酶自述。
1.1、蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊或消化道中提取的一种复合酶，含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶[1]。 蜗牛酶广泛应用于植物细胞壁的溶解，酵母细胞壁的破碎和细胞生物学和基因工程学上的研究。蜗牛酶还可作为纺织工业、果汁酒类食品工业、高级动物饲料生产的添加剂。
1.2，蜗牛酶内包含的二十余种酶中，具有应用价值的主要有以下九种酶，它们分别是： 纤维素酶、 果胶酶、 α-淀粉酶、 1,4-β-D甘露糖内切酶、 β-D葡萄糖水解酶、 α-甘露糖苷酶、 甘露糖醇氧化酶、 氨基酸转移酶和胆碱脂酶[2] 。
其含量如下：
纤维素酶 10%
果胶酶 10%
α-淀粉酶 8%
1，4-β-D甘露糖内切酶 0.3%
β-D葡萄糖水解酶 0.5%
α-甘露糖苷酶 0.3%
甘露糖醇氧化酶 0.3%
氨基酸转移酶 0.5%
胆碱脂酶 0.1%
其中胆碱脂酶在国防科技领域有着重大意义，大部分靠进口，价格十分昂贵。据我们了解，目前国内已有分离技术成果的报道，我们正在寻求帮助。
（以上数据是吉林大学药学院的实验结果--福建金田生物公司提供蜗牛酶）
二、 药用植物提取工艺上的复合酶应用浅析。
2.1，中药中的植物药占有比例达90%以上，药用植物主要的或者全部的有效成分（原生质体）被包裹或隐藏在植物的细胞壁内。植物的细胞壁主要是由纤维素，半纤维素，果胶质，木质素等物质构成的紧密结构[3].
2.2，要提取药用植物中的有效成分，使细胞的原生质体向提取介质扩散从而达到收取的目的，首先必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。通过选用合用的“复合酶”：主要是纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等作用于药用植物细胞，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质的结构受到破坏、降解，引起细胞壁及细胞间质结构产生疏松、膨胀、破裂等变化，减少细胞壁、细胞间质对原生质体向外扩散和游离的屏蔽和阻力，从而达到提高有效成分提取率的目的[4]。这就是通常我们所说的细胞破壁工艺。
2.3，植物原生质体即除去植物细胞壁的裸露植物细胞。早在1960年，国外科学家就采用酶法游离细胞的原生质获得成功，之后，药用植物的原生质体培养和研究不断深入，我国科学家在这一领域也获得许多成果。
通过不同的酶组合，盛世红等认为蜗牛酶能显著促进防风植物原生质体的游离；王济玫等认为蜗牛酶对前胡原生质体的游离具有显著的促进作用；由于蜗牛酶一般作用于B-1，3糖苷键，在伞形科其他植物原生质体游离时与蜗牛酶的作用相似，实验结果表明伞形科植物细胞壁可能普遍存在B-1，3糖苷键的化合物[5]。
以上实验结果表明，复合酶（蜗牛酶）对大部分植物的细胞的原生质体具有游离作用。
2.4.1，陈启超等采用复合酶解法提取香菇多糖蛋白，与单纯热水浸提等其他方法相比，总氨基酸与必须氨基酸含量均提高2倍以上；且大大强化抗肿瘤、抗病毒多糖的分布，香菇多糖的含量提高了近4倍。
2.4.2，张欣等利用复合酶解法结合热水浸提法提取香菇多糖，与单纯热水浸提法相比，提取时间缩短了一半，提取率提高了2倍。
2.4.3，杨吉霞等用复合酶解法与醇提法对一些药用植物提取进行比较发现，酶解法反应条件温和环保，能够保持天然植物的原本构象，不会破坏其立体结构和生物活性，有利于保持原有药效成分。而有些药用植物进过醇处理后，其有效药用成分发生了不同程度的改变或丢失，影响了中药制剂的药理作用和疗效。
2.4.4，刘佳佳等将金银花在以乙醇提取前，用复合酶联合处理，结果表明能显著提高金银花提取物中绿原酸的提取率。郑立殷等为提高黄芪有效成分的提取率，在水提前用纤维素酶进行预处理，结果表明黄芪甲苷的提取率比水提法增加了1.5倍；黄芪多糖的收取率增加了3倍以上。
2.4.5，王元凤等将复合酶用于茶多糖的提取，使茶叶细胞壁破裂，促进多糖溶出，提高收取率和缩短了时间。实验获得的复合酶最佳处理条件可供参照：于40度C、pH值5.5、加酶量0.5%条件下提取3h，茶多糖的提取率为3.29%，是水提法的2.7倍。
2.4.6，侯嵘峤等首先将工业纤维素酶应用于中药及药渣中，使中药及药渣的纤维素酶解为β-葡萄糖，变渣为药，变废为宝，这对中药制药工业是一个开源节流的创举[6]。
2.4.7，马田田等用黄柏提取小檗碱之前经纤维素酶进行预处理，可提高小檗碱收率，并与未加酶的提取工艺进行比较，有显著性差异。因而可考虑将纤维素酶用于其它天然产物的提取。
2.4.8，张彩霞等将纤维素酶应用于穿山龙提取薯蓣皂苷元，其工艺只比原工艺多了一步对原药材饮片的酶解处理，但在纤维素酶的作用下，提高了薯蓣皂苷元的收率，两种方法对比有显著性差异。
2.4.9，李元波等用冷浸法和复合酶法联合使用，与传统的乙醇回流法和渗透法相比，显著提高三七总皂苷的提取率。
2.5， 马桔云等在穿心莲提取穿心莲内酯之前，经纤维素酶进行酶解，与原提取工艺相比较，提高了穿心莲内酯的含量和提取量，经薄层层析检测，两种提取工艺所得成分没有差异，说明酶的加入对所提有效成分没有影响。
2.5.1，马桔云、赵晶岩等选用黄连提取小檗碱，研究了其加酶组和未加酶组对有效成分小檗碱提取的影响，新工艺比原工艺只是多了一步向其中加入纤维素酶的酶解过程，但两种工艺提取的小檗碱含量有显著差异，而提取的成分一致，因此，考虑是否将此新工艺用于黄连提取的工业化中[7]。
2.6 有实验对药用植物提取后的残渣观察表明，通过酶解法提取后遗留的残渣，植物细胞的破碎程度大大高于没有经过酶解的。
酶解法只要在原工艺（不管是煎煮法或最先进的“XX超法”）的基础上增加一个操作过程，对原有工艺勿需进行较大的改变，就可以简便操作，运行成本和工艺要求都较低。
加入酶解工艺后的收取率提高和药效改善情况比较
序 实验人 提取物名称 收 取 率 提 高
1 陈启超 香菇总氨基酸 ============ 2倍
2 陈启超 香菇多糖蛋白 ============================== 4倍
3 张 欣 香菇多糖 =（时间缩短2倍）== 2倍
4 郑立殷 黄芪甲苷 ========== 1.7倍
5 郑立殷 黄芪多糖 ==================== 3倍
6 王元凤 茶多糖 ================= 2.7倍
7 杨吉霞 一般中药 ====能保持原有药效成分===
8 刘佳佳 金银花绿原酸 ===显著提高提取率====
9 李元波 三七总皂苷 ===显著提高提取率===
10 候嵘峤 药渣B-葡萄糖 ==变废为宝==提高提取率==
11 马田田 黄柏小檗碱 ==显著提高提取率==
12 张彩霞 穿山龙署预皂苷 ==显著提高提取率==
13 马吉云 穿心莲 ==显著提高内脂含量==
14 显微镜观察 药渣 ==细胞破碎率大大提高==
三、 中药要发展和对世界做出更大贡献遇到的问题思考。
3.1，有位中医药学院的老教授在一次演讲问他的听众: “祖先谱写5000年的中草药历史 = 树棍 + 树叶？ 我们还要吃多久？” 传统的工艺遇到新的挑战，已到了刻不容缓的地步。中药要如何发展和对世界做出更大贡献？我们对中药注射剂的几次事故记忆犹新；全球对药品的安全提出了几近苛刻的要求；环保生产与环境友好相处的压力；政府和组织对生产安全、员工保护越趋重视；生产成本与市场竞争；全国中药产品获FDA认证的企业寥寥无几等等，迫使我们要向新技术新、工艺进军。
3.2，中药要发展遇到的被简单和不简单的问题。从科研成果到产业化工艺优化精制过程的问题；在探讨和改进有些缺陷的药典方剂药遇到的管理上的问题；如何一揽子解决传统工艺上的纯度低、含量低、生产不稳定、工艺步骤多、排污多对环境不友好、产品收取率低、浪费原料资源、生产成本高和缺乏市场竞争力等等问题？
3.3, 中药业发展已经获得了质的飞跃，科学技术永远是引领的火车头。药用植物提取技术方法已经从单一发展到多项、多方位以及多种方法联用的和多头并进。中医中药对中华民族、对世界的贡献也是卓著的。但是，中药的成分十分复杂，特别是复方药，对药材的结构机理、药用成分、毒性分析和它们被成复合剂后的反应产生新的有生质研究，是一个浩大的工程。中医药在国际上市场占有率和被认可程度，还有很大的的空间等待着我们去拓展。
3.4, 复合酶法对环境友好，在常温常压下，可以单独实现也可以与任何一种方法联用。在药用植物提取工艺上，复合酶法环保、经济、高效，对中药资源保护，是一种值得推崇的方法，必将对中医中药的发展和走向世界做出一定贡献。
四、 蜗牛酶在药用植物提取的应用工艺上能做些什么？
4.1, 蜗牛酶本身是一种复合酶，对大部分中草药和药用植物的细胞壁起着溶解和破粹作用，能把植物的有效成分充分地释放出来，通过酶解的作用，还可以使细胞分子中的因子变异，产生新的有生质，使药用提取物的比率和有效物质得率大大提高[8]。
4.2, 复合酶法对环境友好，可在常温常压下进行，对工艺条件要求低，可以与任何一种提取方法联用。在传统或现代先进的提取方法基础上增加酶解过程，具有实现容易、提高收取率、节省提取时间、保持植物药效成分的立体结构和活性，药效不发生变化等诸多优点。由于酶具有高度的专一性，故针对植物成分，选择适合的一种酶或者几种酶对其作用，使细胞壁疏松、膨胀、崩溃直至破裂，从而降低细胞内有效成分向提取介质扩散的阻力，提高溶出效率。
4.3,蜗牛酶中主要成分是纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和蛋白酶等，对天然植物细胞壁的破粹、溶解有独特的效果，特别是对高等贵重的中草药及植物药物如：松花粉、灵芝、菌类、天麻、半枝莲、三七、人参…等的有效成分的提取，能显著提高其提取率。
由于高等植物的细胞壁中含有一种难溶解和坚硬的几丁质，一般的方法和物理方法很难破粹和降解它，蜗牛酶能够酶解其98%以上的细胞壁，使其有效药用成分充分释放出来，收取率能够提高3倍至几十倍，是提高经济效益，保护名贵天然药物资源的良好途径[9]。
五、 福建漳州金田生物科技有限公司对业界的承诺。
5.1 “金田生物-蜗牛酶”， 福建金田生物公司曾经是全国蜗牛协会的副会长单位。早在1986年，在中科院的技术指导下从褐云玛瑙蜗牛中提取蜗牛酶获得成功，在全国处于领先地位。当时我国的蜗牛酶靠美国进口，每克达100美金。金田生物-蜗牛酶产品，经中国科学院遗传与发育生物学研究所鉴定，工艺成熟，品质稳定，应用可靠。
目前，有北京、上海有30多家生物科技、生化试剂公司经营代理，全国超过20家医药企业、院校、科研机构用过我们的蜗牛酶，质量和活性都相当好，其中有一家生物进出口企业还把我们的产品介绍出口美国、日本。
5.2 金田生物公司20多年来研制蜗牛酶、喜爱蜗牛酶。但总觉得应用领域还没有真正扩展开来，蜗牛酶被认知的程度还比较低，对植物药物提取，医药业界提供的服务还不够。
5.3 福建漳州金田生物科技有限公司在此郑重承诺：参加本次会议的全国各植物药物提取企业、医药行业和各院校或科研机构，或者需要或者兴趣研究酶的任何单位和个人，或在实验室过程中需要用到蜗牛酶，我们都将免费赠送！
六、 【补充】蜗牛酶的单酶分离技术和蜗牛凝集素的研制。
6.1 蜗牛酶的单酶分离技术。成都大学中药化学实验室的邬晓勇、苟小军等，用金田生物公司提供的蜗牛酶粗品，用分级沉淀方法从蜗牛酶中分离提取出纤维素酶，取得了研究成果[10]。方法是向蜗牛酶粗酶液中加入硫酸铵，使溶液的硫酸铵从10%饱和度以10%为梯度逐渐增加到100%饱和度，结果是达到50%的饱和度分级沉淀蜗牛酶中的纤维素酶的活性最高。
如果把这一分离技术引进到工业上，用50%的饱和度分级沉淀蜗牛酶中的纤维素酶最合理，但硫酸铵有毒性，若用于食用性蛋白，则需要进行脱盐处理，除去硫酸铵。这一研究结果将给蜗牛酶的单酶分离和应用开辟新的领域。
6.2 蜗牛凝集素的研制。北京热景生物技术有限公司的林长青等，2007年专程从北京带技术资料到福建找我们，经过一个多月与我们共同研制，成功地从褐云玛瑙蜗牛和白玉蜗牛的蛋白腺中提取出蜗牛凝集素，活性和品质可与美国进口的婢美，现在已具备工业化生产的条件，此技术填补了国内空白. 北京热景生物公司还用我们生产的蜗牛凝集素生产“检测糖链异常IgA肾病”试剂盒，并申请了专利[11]。
七、 【结语】 植物药物提取工艺中酶法的应用和多种方法联用展望。
酶法用于植物药物提取是从破坏植物的细胞壁着手的，可以说是“碉堡最容易从内部攻破”，使有效药用成分尽量多地释放出来，是一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一，可以单独和传统水提法配合完成提取任务，如果与现代的“超X技术”联用，将起到更佳的效果。
无论是超声波、超滤膜、超临界、超低温、超微粉…，只要工艺过程中有水浸提的中间过程，酶就可以容易介入，先将植物药物细胞壁疏松、膨胀，甚至使其破裂，给下一步提取工艺创造好的条件，达到节能、高效的目的。当然，科学技术在不断发展，酶法提取和联用技术也存在一定的局限性，要靠严格的实验来寻找最佳点。酶的品种浓度、底物的本性和浓度、温度、ph值、酶解时间、抑制剂、溶解剂的选用，工艺技术细节的把握等等都十分关键，使酶法提取技术和其他联用实现无缝连接，还要我们长期艰苦的努力。
（作者 福建漳州金田生物科技有限公司 董事长 电话13906062513）
www.snailase.com 2009年10月26日 于桂林
附件1： 蜗牛酶活性鉴定—由福建金田生物公司提供的蜗牛酶。
（中国科学院遗传与发育生物学研究所---活性鉴定报告-01）
附件2：蜗牛酶一般使用的说明参考---福建漳州金田生物科技有限公司
一、作用概述
植物的有效成分90％ 以上被包裹在植物的细胞壁内。植物细胞大都呈现双凸椭圆形和扁半球状,细胞外径3—6um,细胞壁厚2—3um。微小的细胞壁是一层不溶于水的坚硬几丁质，传统的破碎方法不尽理想。通过蜗牛酶的活性生物作用，可破碎/溶解95%以上的植物细胞壁，药用/营养成分的释放是传统方法的3-5倍（对于灵芝、花粉或菌类、高等植物可达到10倍）。
二、应用范围
植物细胞破壁（中药材/草本植物精华提取；水果/蔬菜营养成分萃取）
三、应用方法
1、 条件：温度40℃-60℃；pH 4.0-6.0。
2、推荐用量：0.1％—0.3％（植物干重）
3、方法：
植物/果浆在30℃左右，具流动性的浆（液）态下轻轻搅拌10min使其均匀，慢慢加热至50-60℃。按推荐量取干品蜗牛酶粉末放入1000ml左右的浆（液）中，轻轻搅拌使其充分溶解，然后均匀搅拌缓缓加入待破壁的植物浆（液）中，恒温酶解3h左右（pH值、恒温时间据具体物料有所不同），可提高温度使酶灭活。酶解结束后按原工艺流程继续进行。
三、应用效果
显著提高药用植物有效成分的提取率。
（福建漳州金田生物科技有限公司--供稿参考）
附件3：专利《一种检测糖链异常IgA肾病的装置及应用此装置的试剂盒》
来源 : 北京市科技情报研究所
申请号： 200710107507 申请日： 2007/05/17
公开日： 2007/10/10 公开号： 101051010
专利类别： 发明 国别省市代码： 11 [中国|北京]
名称： 一种检测糖链异常IgA肾病的装置及应用此装置的试剂盒
国际分类号： G01N 1/34;G01N 33/53;G01N 33/577;G01N 21/76
范畴分类号： 31E
发明人： 林长青 申请人： 北京热景生物技术有限公司
申请人地址： 北京市丰台区科学城航丰路8号中关村丰台园生命科学 孵化中心405室 邮编： 100070
本发明涉及了一种分离ＩｇＡ肾病糖链异常ＩｇＡ的预装离心柱。该离心柱由上部分离管和下部收集管组成。上部分离管装有偶联 蜗牛凝集素（ＨＡＡ- 由福建金田生物科技有限公司提供）的亲合介质，上部分离管底部是一个滤布，下部收集管中装有缓冲溶液。蜗牛凝集素（ＨＡＡ）能与糖链异常ＩｇＡ相结合。经过离心洗脱，获得与蜗牛凝集素ＨＡＡ相结合的糖链异常ＩｇＡ。本发明还涉及了一种含有该预装离心柱的化学发光检测试剂盒和一种含有该预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及其制备、使用方法。
应用该试剂盒可快速、简便的测定糖链异常ＩｇＡ的含量，准确的对ＩｇＡ肾病进行早期诊断，为ＩｇＡ肾病的预防、诊断、治疗提供支持。
（北京热景生物技术有限公司--福建漳州金田生物科技有限公司--供稿）
参考文献：
【1】 新疆蜗牛酶的研制 惠军，吴炎，祝长青。新疆大学学报自然科学版 2006 25（3）： 90-92。
【2】朱婉华 宋东 蜗牛酶的研制及应用 《中国生化药物杂志》 1993年02期
【3】《纤维素酶在中药成分提取中的应用》来源 www.bioon.com 2006-12-17
【4】陈栋 周永传 《酶法在中药提取中的应用和进展》中国中草药杂志 2007年1月第32卷第2期
【5】刘岭 《关于中草药植物细胞工程研究进展的问题》 《中草药》 2002年12期
【6】申彦晶 赵树进《酶工程在中药有效成分提取及转化中的应用》中国医药工业杂志 2007，38（4）
【7】《中草药提取新技术的开发和应用》 中国色谱网 中国医药市场信息网中
2008-08-18草药提取新技术的开发应
【8】【9】蜗牛酶的制备和对酵母细胞壁的作用-《生物化学与生物物理进展》9706期
【10】邬晓勇，苟小军等《蜗牛酶中纤维素酶的分级分离》安徽农业科学 2009，37（4）：1394-1396
【11】林长青 北京热景生物技术有限公司 2007/10/10 专利《一种检测糖链异常IgA肾病的装置及应用此装置的试剂盒》
中草药及天然药物研究暨萃取分离新技术、新产品交流研讨会
中国中医药研究促进会 论文选 2009-10-26 中国桂林
www.snailase.com 福建漳州金田生物科技有限公司 www.snailase.cn
金田=蜗牛酶
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